即時螢光定量 PCR（qPCR）大幅提升了核酸偵測與定量分析的效率，具備高靈敏度、檢測速度快與應用彈性高等優勢。 許多即時 PCR 實驗在每個反應孔中只檢測一個靶標，這種方式稱為單重 qPCR（Singleplex qPCR）。

而透過多重 qPCR（Multiplex qPCR），可進一步提升即時 PCR 的檢測效率。多重 qPCR 可在同一個反應孔中，同時擴增並偵測多個相互獨立的目標序列，因此能以較少的反應次數取得更多分析資料，同時提升試劑使用效率與實驗重複性。

無論是進行基因表達分析還是病原體檢測，多重 qPCR 都能有效簡化實驗流程。 從單重到多重：工作原理。
 

一個典型的即時 PCR 實驗通常包含：一對引物

典型的即時 PCR 反應通常包含一對引子。若使用 TaqMan™ 探針法，反應中還會加入帶有螢光標記的探針；在單重 qPCR 實驗中，每個反應孔通常只擴增並偵測一個目標序列。

在多重 qPCR 中，則可在同一個反應孔中同時擴增兩個或多個靶標，每個靶標通過帶有不同螢光染料的探針進行區分。

在現有的 qPCR 反應系統中，TaqMan™ 探針法相當適合多重 qPCR。由於探針本身具有高度專一性，且每組探針可搭配不同螢光染料，因此能以不同螢光訊號區分各個目標序列。

這種「雙重優勢」使研究人員能夠在一次反應中擴增多個檢測專案，並分別對每個靶標進行準確檢測。
 

為什麼選擇多重 qPCR？

與單重 qPCR 相比，多重 qPCR 具有顯著優勢：更高的通量，每孔檢測更多靶標，提高整塊反應板的檢測效率，更低的試劑和樣本消耗，更高效地利用昂貴試劑和有限的生物樣本。

更高的精密度與可靠性：多重 qPCR 可將目標序列與內部對照放在同一反應孔中進行分析，有助於降低孔間差異，並提升數據的可比性與可信度。通常，從雙重 qPCR（Duplex）開始是一個現實可行的第一步。隨著技術發展，通過在單個反應中結合3個或更多靶標，多重qPCR 的優勢將進一步放大。 在Thermo Fisher Scientific 提供的先進工具、服務和產品支援下，高階多重qPCR（最多 6 個靶標）已不再遙不可及。

什麼時候最適合使用多重 qPCR？

在以下情況下，多重 qPCR 的價值尤為突出：需要對大量樣本使用相同的一組檢測專案。

對數據品質和品質控制要求較高，樣本量有限或樣本十分珍貴，若研究中需要偵測的目標數量較多，例如超過 12 個，則可考慮使用即時 PCR 晶片陣列（qPCR Array），以提升整體分析效率。

隨著多重反應中靶標數量增加（3–6 個），實驗設計的複雜性也會顯著提升。此時，一些技術應用科學家（TAS）和現場應用科學家（FAS）可提供專業指導。
 

如何設計一個成功的多重 qPCR 實驗？

成功的多重qPCR流程需要合理的實驗設計與充分的測試，主要包括以下幾個方面：

選擇相容的檢測專案，首先確定你希望組合的檢測專案。 可實現的多重數量取決於儀器的光學檢測通道數。例如：如果儀器具備6個檢測通道，理論上最多可同時檢測 6個靶標。
可使用 qPCR Assay Design Hub 中的 Multiplexing Support Request Tool 檢查檢測專案的相容性。多重分析支援團隊亦可提供電腦模擬分析，協助評估引子或探針之間是否可能產生相互干擾。

選擇合適的螢光染料

合理的染料選擇有助於實現清晰的光譜區分。

推薦使用的染料包括：FAM、VIC ROX、Cy5、Cy5.5、CY3 大多數 Applied Biosystems™試劑都包含被動參比染料 ROX™，在多重 qPCR 中尤為有益。

Q9600 系列可在無須 ROX 通道的情況下進行多重 qPCR 實驗，並可依需求選擇對應的螢光染料，無須額外進行染料校正。
 

引物濃度優

在單重TaqMan實驗中，通常推薦使用統一的引物濃度（900 nM）。

但在多重反應中，如果仍使用該濃度，可能會導致：高豐度靶標迅速擴增。

Taq DNA 聚合酶被“耗盡”或飽和抑制低豐度靶標的擴增為避免這種情況，可對某些檢測項目採用降低引物濃度的策略。
 

研究人員應根據各靶標的預期豐度，決定哪些檢測專案需要進行引物限制。 原理說明：

普通條件下，高豐度靶標擴增至聚合酶飽和後進入線性期低豐度靶標也被迫進入線性期，Ct 值不準確甚至無法檢測，通過引物限制，使擴增因引物耗盡而非聚合酶飽和進入線性期，從而保證低豐度靶標仍處於指數擴增階段 提供：VIC 標記、引物限制（PL）格式的基因表達檢測，定製 TaqMan™基因表達檢測特殊寡核苷酸合成服務，可選擇不同染料與PL格式，放大規模前的性能測試在正式應用多重 qPCR 之前，必須對其性能進行驗證。

更嚴格的方法：混合標準曲線將一個靶標進行系列梯度稀釋同時加入固定量的第二個靶標。 在即時PCR中擴增混合樣本。理想情況下，兩個靶標在整個檢測範圍內都應保持良好的線性關係對於三重或更高階多重反應，需要測試多組靶標組合。

較簡化的方法：對同一批樣本分別進行單重和多重擴增比較兩種結果的一致性將多重檢測整合為單管試劑，如果多重 qPCR 的性能驗證結果令人滿意，可使用特殊寡核苷酸將所有檢測專案預混為單管形式。

其優勢包括：簡化實驗配製流程，確保引物和探針比例一致，提高實驗重複性。