前言

在分子生物學實驗中，核酸濃度與純度的準確評估，是後續 PCR、qPCR、基因定序等實驗能否順利進行的重要前提。若核酸濃度過高，可能抑制反應系統；濃度過低則可能影響偵測靈敏度，甚至導致實驗失敗。

目前核酸定量常用的方法主要可分為吸光度法與螢光法。對應儀器包括微量分光光度計、螢光計，以及適用於高通量檢測的螢光酵素免疫分析儀，或具螢光偵測功能的微孔盤分析儀。雖然這些儀器最終都可提供濃度數值，但其檢測原理、靈敏度、特異性與適用情境並不相同。

本文將從檢測原理與實際應用切入，說明不同核酸定量工具的特性，協助使用者依樣品類型與實驗需求，選擇合適的定量方式。



01 檢測原理的差異
微量分光光度計：利用核酸的紫外吸收特性進行檢測

微量分光光度計是最常見、也最基礎的核酸定量工具之一，其原理建立在核酸對紫外光的吸收特性上。核酸分子中的嘌呤與嘧啶鹼基會在 260 nm 具有明顯吸收，而蛋白質等常見雜質則主要吸收 280 nm 的紫外光。

儀器藉由量測 260 nm 的吸光值（A260），再依據朗伯－比爾定律（Beer-Lambert Law）計算樣品濃度：

A = kbc

其中：

● A：吸光值，表示光通過樣品後強度衰減的程度

● k：比例常數，與波長、溶質性質及溶劑性質有關

● b：光徑長度，通常以 cm 表示

● c：吸光物質濃度



再搭配常用換算公式，例如：
● 1 A260 = 50 μg/mL dsDNA
● 1 A260 = 40 μg/mL RNA
即可快速估算核酸濃度。

此外，微量分光光度計也常透過 A260/A280 比值 來評估樣品純度。一般而言，DNA 的 A260/A280 約在 1.8 左右，RNA 約在 2.0 左右；若比值明顯偏離，通常代表樣品中可能含有蛋白質、酚類或其他污染物。

簡單來說，微量分光光度計的優點是不需額外試劑、操作快速、可同時提供濃度與純度資訊。但由於所有核酸在 260 nm 都會吸光，因此無法分辨 dsDNA、ssDNA 或 RNA 的差異；若樣品中含有鹽類、酚類或其他雜質，也可能影響定量結果。換句話說，它非常適合用於快速初步評估，但在低濃度或高干擾樣品中，定量準確度通常不如螢光法。


螢光計與螢光酵素免疫分析儀：利用螢光染劑進行專一性定量
螢光法的核心原理，是利用特定波長的激發光照射樣品中的螢光染劑，再藉由量測所發出的螢光強度來換算目標物濃度。

這類方法通常需搭配具專一性的螢光染劑使用。例如 dsDNA 定量試劑中的染劑，通常只會與雙股 DNA 結合，而不會明顯與 ssDNA 或 RNA 反應。當染劑尚未與目標核酸結合時，背景螢光通常較低；一旦與目標分子結合後，螢光訊號會顯著增強。於試劑盒建議的定量範圍內，螢光強度通常與核酸濃度呈良好的線性關係，因此可得到較高準確度的定量結果。


簡單來說，螢光法的特點是專一性高、靈敏度高、較不易受到蛋白質、游離核苷酸或鹽類等雜質影響，因此特別適合低濃度樣品的定量。不過，螢光法通常無法直接提供樣品純度資訊，且需搭配對應試劑使用，檢測成本會相對較高。

若使用的是螢光酵素免疫分析儀或具螢光偵測模組的微孔盤系統，則其檢測原理與螢光計相同，但能進一步支援較高通量的樣品分析，更適合批次檢測需求。



02 在常見分子檢測應用中的優缺點

以下以 PCR / qPCR 與 NGS（次世代定序） 兩類常見應用為例，說明不同儀器在實務上的適用性。


PCR 檢測（包含常規 PCR 與 qPCR）
PCR 相關實驗對核酸定量的要求，通常著重於快速確認濃度是否落在可用範圍內，並排除明顯污染所造成的反應抑制。在多數情況下，若樣品濃度足夠且純度合理，便能滿足 PCR 反應需求，因此未必需要追求極限靈敏度。


微量分光光度計
優點：
● 檢測速度快，通常數秒內即可完成
● 不需額外試劑，使用成本低
● 可同時提供濃度與純度資訊（如 A260/A280）
● 操作簡單，適合常規 PCR 樣品的快速初篩

缺點：
靈敏度相對較低，對低濃度樣品較不利
無法分辨不同類型核酸
易受酚類、鹽類或其他雜質干擾，影響定量準確性


螢光計、螢光酵素免疫分析儀
優點：
● 靈敏度高，適合低濃度樣品
● 特異性佳，可依染劑區分 dsDNA、RNA 等不同目標
● 不易受蛋白質、鹽類等雜質干擾，結果較準確

缺點：
● 僅能提供濃度資訊，無法直接判斷純度
● 需搭配螢光試劑，檢測成本較高
● 操作上對加樣準確度較有要求
● 相較微量分光法，整體流程較花時間

結論：
若是一般 PCR 或 qPCR 的日常檢測，微量分光光度計通常已可滿足快速篩選需求；若樣品濃度偏低、來源複雜，或對定量準確度要求較高，則螢光法會是更合適且穩定的選擇。


NGS（次世代定序）
NGS 對核酸定量的要求通常高於一般 PCR。尤其在文庫建構前，樣品濃度的準確性、批次間一致性，以及低濃度樣品的可定量性，都會直接影響後續文庫品質與定序結果。有些樣品的初始濃度甚至低於 1 ng/μL，此時更需要高靈敏度與高重複性的定量方式。


微量分光光度計
優點：
● 可快速檢查樣品是否有明顯污染
● 無需試劑，適合前期快速篩選
● 可作為初步純度評估工具，先排除品質明顯不佳的樣品

缺點：
● 對低濃度樣品的靈敏度不足
● 無法判斷核酸是否降解
● 定量結果容易受背景雜質影響
● 不建議作為 NGS 文庫建構前的最終定量依據


螢光計
優點：
● 靈敏度高，適合低濃度 DNA / RNA 定量
● 特異性佳，結果較不受雜質影響
● 重複性通常優於吸光度法
● 適合作為 NGS 樣品或文庫的定量工具

缺點：
● 單次可處理樣品數有限
● 對大量樣品時，操作效率較低
● 試劑成本相對較高


螢光酵素免疫分析儀 / 微孔盤螢光定量系統
優點：
● 適合大量樣品的批次定量
● 可搭配 96 孔盤等高通量格式進行分析
● 兼具高靈敏度、高特異性與良好重複性
● 特別適合 NGS 樣品量大、需一致性管理的實驗室流程

缺點：
● 儀器建置成本較高
● 試劑耗材成本也較高
● 操作與系統維護相對需要較完整的訓練

結論：
對於 NGS 應用而言，微量分光光度計較適合作為前段品質初篩工具，而螢光法才是較適合用於最終濃度定量的方式。若實驗室有大量文庫樣品需處理，則具螢光偵測功能的高通量平台會更能兼顧效率與一致性。

 

一表掌握三類核酸定量儀器的選擇重點

最後補充：關鍵選型建議

若實驗室主要進行常規 PCR 與少量樣品檢測，且重視操作效率與成本控制，則微量分光光度計通常已足以滿足日常基礎定量與純度評估需求。

若樣品屬於低濃度核酸或微量樣本，例如 cfDNA，且單次檢測樣本數不多，則較適合使用螢光計，以兼顧靈敏度與定量準確性。

若實驗室需處理大量樣品，或應用情境涉及 NGS、文庫建構前定量或其他高通量分析流程，則較適合使用具螢光偵測功能的高通量平台，例如螢光酵素免疫分析儀。雖然整體建置與試劑成本較高，但在檢測效率、數據一致性與結果穩定性方面，通常更具優勢。